qPCR lyophilisée vs PCR avec réactif humide et LAMP pour le dépistage des agents pathogènes des crevettes à la ferme

Pourquoi les crevettes sont criblées et non traitées

Les crustacés n’ont qu’un système immunitaire inné : pas d’anticorps, pas de mémoire immunitaire, pas de vaccin. Un étang qui a survécu aux taches blanches l’année dernière n’est pas protégé cette année. Le contrôle signifie donc l'exclusion des post-larves, des géniteurs, des aliments vivants et des porteurs infectés, ainsi qu'une détection précoce pendant la culture afin qu'un résultat positif déclenche une récolte partielle ou un changement de gestion avant l'effondrement de l'étang. Chacune de ces décisions est un test moléculaire, et la plupart d’entre elles doivent être prises là où il n’y a pas de laboratoire.

Quatre méthodes moléculaires comparées

PCR conventionnelle et nichée. La référence historique pour WSSV, IHHNV et EHP. Deux cycles d'amplification et un gel donnent une sensibilité très élevée, mais le deuxième cycle en tube ouvert est la source classique de contamination des amplicons, l'analyse prend trois à quatre heures, le résultat est une bande lue à l'œil nu et nécessite un laboratoire approprié avec des pièces séparées.

PCR (quantitative) en temps réel. Détection de fluorescence en tube fermé, résultat en une heure environ et valeur seuil de cycle qui reflète la charge pathogène. La charge compte chez les crevettes : un faible positif dans un bassin de grossissement et un fort positif dans un lot de post-larves nécessitent des actions différentes. WOAH répertorie la PCR en temps réel ainsi que la PCR nichée comme méthode recommandée pour les principaux virus de la crevette.

LAMP et autres produits chimiques isothermes. Chauffage simple et rapide, lecture visuelle. Attrayant pour une utilisation sur le terrain, mais la conception des amorces pour LAMP à six amorces est difficile, le multiplexage est limité et le rendement très élevé de l'amplicon fait de la contamination par transfert un risque persistant dans une exploitation agricole. Il est préférable de l’utiliser comme écran à cible unique avec une séparation physique stricte des étapes.

PCR en temps réel lyophilisée (lyophilisée). La même chimie que la qPCR avec réactif humide, avec le mélange maître, les amorces et la sonde séchées dans le tube. Le kit est expédié et stocké à température ambiante, l'opérateur ajoute l'extrait et l'eau, et le tube va directement dans l'analyseur. Il supprime le congélateur, le pipetage des enzymes et la plupart des possibilités de contamination en une seule étape.

Ce que change la lyophilisation

Chaîne du froid. Un mélange maître humide doit rester congelé de l’usine au banc et ne tolère que quelques cycles de gel-dégel. Une ferme située à trois heures du congélateur le plus proche, ou un couvoir dont l'électricité tombe en panne chaque semaine, ne peuvent pas le contenir. Un tube lyophilisé est stable pendant des mois à température ambiante, le kit peut donc être posé sur une étagère dans le bureau du couvoir.

Étapes pratiques. Avec des réactifs humides, l'opérateur pipette le tampon, l'enzyme, les amorces, la sonde et le gabarit dans chaque tube ; chaque transfert est une opportunité de contamination et une exigence de formation. Avec le tube séché, il y a deux ajouts, extrait et eau. C'est pourquoi un technicien de couvoir ayant une formation d'une journée le gère de manière fiable.

Cohérence. Chaque tube d'un lot contient la même masse de réactif ; il n'y a pas de variation de pipetage entre les analyses ou les opérateurs, ce qui rend les valeurs Ct comparables d'une semaine à l'autre sur le même bassin.

Sensibilité. La chimie lyophilisée correctement formulée correspond à son équivalent humide ; la lyophilisation protège l'enzyme plutôt que de la dégrader. Les limites de détection pour la ligne d'aquaculture sont indiquées par kit sur les pages produits.

Un plan d'échantillonnage qui veut dire quelque chose

Un test négatif sur dix crevettes en dit peu sur un étang d’un million. Les tableaux d'échantillonnage WOAH donnent le nombre d'animaux nécessaires pour détecter un agent pathogène à une prévalence donnée avec un degré de confiance de 95 pour cent dans une grande population : 150 animaux pour une prévalence de 2 pour cent, 60 pour 5 pour cent, 30 pour 10 pour cent. Les post-larves sont regroupées, de sorte qu'un test de certification sur un lot est généralement un échantillon regroupé de 150 animaux, parfois divisé en plusieurs pools afin qu'un résultat positif puisse être localisé.

Pendant la culture, un échantillon regroupé de 10 à 20 crevettes provenant du bac d'alimentation toutes les deux à trois semaines, plus des sédiments de la zone d'alimentation entre les cultures, constitue un minimum pratique. Les géniteurs sont testés de manière non létale à partir de matières fécales ou de biopsies de pléopodes ; les aliments vivants tels que les polychètes sont testés par lots avant d'entrer dans le couvoir.

Le flux de travail de la ferme, de l'échantillon à la décision

Collecter : post-larves, tissus, branchies, hépatopancréas, fèces, aliments ou eau, à l'étang ou au couvoir. Préparez : un tampon sans extraction pour les tissus en cinq minutes, ou le kit de billes magnétiques pour l'eau, les sédiments et les lots. Run : réhydrater le tube lyophilisé avec l'extrait, charger l'analyseur compact 24 puits, résultat environ 50 minutes avec le Ct à l'écran. Décidez : rejetez ou acceptez le lot, arrêtez ou continuez l’alimentation vivante, récoltez tôt ou terminez le cycle. Toute la boucle se boucle en une après-midi, sur place, ce qui fait la différence entre un programme de dépistage qui existe et celui qui existe sur papier.

Coût, dans les seules unités qui comptent

Un test coûte quelques dollars de réactif et une heure du temps d'un technicien. Une récolte perdue coûte le stockage, le fourrage, l'énergie et la saison. Une écloserie qui certifie chaque lot par qPCR vend des post-larves à un prix plus élevé et fidélise ses clients ; une ferme qui effectue un dépistage au moment du stockage et toutes les deux semaines convertit une épidémie de WSSV d'une perte totale en une récolte précoce partielle. La comparaison entre les méthodes ci-dessus est réelle, mais la comparaison entre tester et ne pas tester est celle qui décide si la ferme est toujours là l'année prochaine.

Écrit par l'équipe produit Medicare Vet à partir des données du fabricant, des conseils WOAH et de la validation publiée. Ne remplace pas les conseils d'un vétérinaire ou d'un laboratoire sur votre marché.