Лиофилизированная кПЦР по сравнению с ПЦР с влажным реагентом и LAMP для скрининга патогенов креветок на ферме

Почему креветок проверяют, а не лечат

У ракообразных есть только врожденная иммунная система: ни антител, ни иммунной памяти, ни вакцины. Пруд, переживший в прошлом году белую пятнистость, в этом году не охраняется. Таким образом, контроль означает исключение инфицированных постличинок, производителей, живых кормов и носителей, а также раннее обнаружение во время сбора урожая, чтобы положительный результат вызвал частичный сбор урожая или смену управления до того, как пруд обрушится. Каждое из этих решений представляет собой молекулярный тест, и большинство из них приходится принимать там, где нет лаборатории.

Сравнение четырех молекулярных методов

Традиционная и вложенная ПЦР. Историческая справка по WSSV, IHHNV и EHP. Два раунда амплификации и гель дают очень высокую чувствительность, но второй раунд в открытой пробирке является классическим источником загрязнения ампликона, анализ занимает три-четыре часа, результат - полоса, считываемая на глаз, и для этого требуется соответствующая лаборатория с отдельными помещениями.

ПЦР в реальном времени (количественная). Обнаружение флуоресценции в закрытой пробирке, результат примерно через час и пороговое значение цикла, которое отражает нагрузку патогенов. Для креветок нагрузка имеет значение: слабый положительный результат в пруду для выращивания и сильный положительный результат в партии постличинок требуют разных действий. WOAH называет ПЦР в реальном времени наряду с вложенной ПЦР рекомендуемым методом для выявления основных вирусов креветок.

LAMP и другие изотермические химические процессы. Быстрый, простой нагрев, визуальное считывание. Привлекателен для использования в полевых условиях, но разработка праймера для LAMP с шестью праймерами сложна, мультиплексирование ограничено, а очень высокий выход ампликонов делает перенос загрязнения постоянным риском в условиях фермы. Его лучше всего использовать в качестве одноцелевого экрана со строгим физическим разделением ступеней.

Лиофилизированная (лиофилизированная) ПЦР в реальном времени. Тот же химический состав, что и для qPCR с влажным реагентом, с мастер-миксом, праймерами и зондом, высушенными в пробирке. Комплект поставляется и хранится при температуре окружающей среды, оператор добавляет экстракт и воду, и пробирка поступает прямо в анализатор. Он удаляет морозильную камеру, пипетирование ферментов и большинство возможностей загрязнения за один этап.

Что меняет лиофилизация

Холодовая цепь. Влажная мастер-смесь должна оставаться замороженной на пути с завода до стенда и выдерживать лишь несколько циклов замораживания-оттаивания. Ферма в трех часах езды от ближайшей морозильной камеры или инкубаторий, у которого еженедельно отключается электричество, не смогут его выдержать. Лиофилизированная пробирка стабильна в течение нескольких месяцев при температуре окружающей среды, поэтому набор можно хранить на полке в офисе инкубатория.

Практические шаги. При использовании влажных реагентов оператор пипеткой вносит в каждую пробирку буфер, фермент, праймеры, зонд и матрицу; каждый перевод представляет собой возможность заражения и требует обучения. К высушенной трубке добавляются две добавки: экстракт и вода. Вот почему техник инкубатория, прошедший однодневное обучение, надежно управляет им.

Последовательность. В каждой пробирке партии содержится одна и та же масса реагента; нет различий в пипетировании между сериями или операторами, что делает значения Ct сопоставимыми от недели к неделе в одном и том же пруду.

Чувствительность. Правильно составленный лиофилизированный химический состав соответствует его влажному эквиваленту; лиофилизация защищает фермент, а не разрушает его. Пределы обнаружения для линии аквакультуры указаны для каждого набора на страницах продукта.

План выборки, который что-то значит

Отрицательный тест десяти креветок мало что говорит о пруде в миллион. В таблицах выборки WOAH указано количество животных, необходимое для обнаружения возбудителя при заданной распространенности с 95-процентной достоверностью в большой популяции: 150 животных для 2-процентной распространенности, 60 для 5 процентов, 30 для 10 процентов. Пост-личинки объединяются, поэтому сертификационное испытание партии обычно представляет собой объединенную выборку из 150 животных, иногда разделенную на несколько групп, чтобы можно было локализовать положительный результат.

Практическим минимумом во время выращивания является сбор от 10 до 20 креветок из лотка для кормления каждые две-три недели, а также осадок из зоны кормления между посевами. Маточное стадо проверяется на нелетальный результат по фекалиям или биопсии плеопод; Живые корма, такие как полихеты, тестируются партиями перед поступлением в инкубаторий.

Рабочий процесс фермы: от образца к решению

Собирайте: постличинки, ткани, жабры, гепатопанкреас, фекалии, корм или воду в пруду или инкубаторе. Приготовьте: не требующий экстракции буфер для ткани за пять минут или набор магнитных шариков для воды, осадка и партий. Запуск: повторно увлажните лиофилизированную пробирку с экстрактом, загрузите компактный 24-луночный анализатор, результат примерно через 50 минут с Ct на экране. Решите: отклонить или принять партию, прекратить или продолжить живое кормление, досрочно собрать урожай или завершить цикл. Весь цикл завершается во второй половине дня на месте, в чем разница между действующей программой скрининга и той, которая существует на бумаге.

Стоимость, в единственных единицах, которые имеют значение

Тест стоит несколько долларов реагента и час времени техника. Потеря урожая приводит к расходам на поголовье, корм, электроэнергию и сезон. Инкубаторий, который сертифицирует каждую партию с помощью количественной ПЦР, продает постличинки с наценкой и удерживает своих клиентов; ферма, которая проводит проверку при зарыблении и каждые две недели превращает вспышку WSSV из полной потери в частичный ранний урожай. Сравнение приведенных выше методов реально, но именно сравнение тестирования и отсутствия тестирования решает, сохранится ли ферма в следующем году.

Написано командой разработчиков Medicare Vet на основе данных производителя, рекомендаций WOAH и опубликованных подтверждений. Не заменяет ветеринарную или лабораторную консультацию на вашем рынке.