Панели мультиплексной ПЦР в реальном времени против тестов с одной мишенью: синдромное тестирование в ветеринарной лаборатории

Почему синдромы, а не патогены

Комплекс инфекционно-респираторных заболеваний собак включает вирус чумы чумы, парагриппа, аденовирус 2-го типа, гриппа, респираторный коронавирус, Bordetella bronchiseptica и Mycoplasma cynos в любом сочетании. Заболевания верхних дыхательных путей у кошек сочетают калицивирус и герпесвирус с микоплазмой, хламидией и бордетеллой. Диарея у кошек и собак может быть вызвана парвовирусом, коронавирусом, лямблиями, тритрихомонадами, криптоспоридиями, клостридиями и сальмонеллами. Обследования клинических случаев обычно обнаруживают два или более агентов в трети или более положительных проб.

В этом случае одноцелевой тест отвечает на вопрос, который задает врач, а не на вопрос, который задает пациент. Отрицательный результат на парвовирус у щенка, которого рвало, обнадеживает только в том случае, если также известны результаты на коронавирус, лямблии и клостридии. Панель преобразует последовательность догадок в один упорядоченный ответ.

Как работает мультиплексирование

Каждая мишень имеет свою собственную пару праймеров и зонд, меченный разными флуорофорами: FAM, HEX или VIC, ROX или Texas Red, Cy5, а на шестиканальных приборах Cy5.5 или аналогичным красителем. Прибор считывает каждый канал отдельно в каждом цикле, поэтому одна скважина отображает одну кривую для каждой цели. Внутренний контроль, обычно эндогенный ген хозяина или добавленная синтетическая последовательность, занимает один канал и подтверждает, что экстракция сработала и реакция не ингибировалась.

Четыре-шесть целей на лунку — это практический потолок для большинства приборов; Панели большего размера состоят из двух или трех лунок на образец, поэтому желудочно-кишечная панель из восьми элементов упаковывается в несколько пробирок.

Сколько стоит мультиплексирование и как оно контролируется

Конкурс праймеров. Мишени разделяют полимеразу, нуклеотиды и время цикла, поэтому мишень с высокой нагрузкой может подавлять амплификацию мишени с низкой нагрузкой в ​​той же пробирке. Хорошо спроектированные панели уравновешивают концентрации праймеров и подтверждают во время проверки, что предел обнаружения каждой мишени в мультиплексе находится в пределах цикла или около того ее значения в синглплексе.

Перекрестные помехи. Флуорофоры с перекрывающимися спектрами просачиваются в соседние каналы; Это контролируется калибровкой прибора и выбором красителя комиссией, а проверка включает в себя единичные положительные образцы в каждом канале, чтобы доказать это.

Интерпретация. Группа дает больше положительных результатов, некоторые из них — комменсалы или свидетели. Микоплазма и Bordetella, в частности, обнаруживаются у здоровых носителей, поэтому в отчете должно быть указано значение Ct, а врач должен определять поздний Ct для организма-носителя иначе, чем ранний Ct для вируса чумки.

Когда комплект для одной цели по-прежнему является правильным выбором

Подтверждение положительного результата панели независимым анализом. Количественный мониторинг одного патогена с течением времени, например вирусной нагрузки при лечении, где самая чистая кривая получается в результате специальной реакции. Редкие или экзотические мишени, которые не указаны ни в одной панели, включая зоонозные агенты, такие как бруцеллы, лептоспиры или лейшмании, если клинический вопрос является специфическим. Нормативное или экспортное тестирование, в котором указывается метод. И любая лаборатория, прибор которой имеет всего один-два канала.

Создание панели меню

Ветеринарная лаборатория, обслуживающая общую практику, обычно располагает респираторной панелью и желудочно-кишечной панелью для собак и кошек, панелью трансмиссивных заболеваний (эрлихии, анаплазмы, бабезии, дирофилярии, лейшмании), сформированной на основе местной карты клещей и москитов, и набором одноплексных наборов для подтверждения, а также для зоонозных и репродуктивных вопросов. Все они работают с использованием одного и того же извлечения, одного и того же инструмента и одного и того же шаблона отчетности, что является практическим аргументом в пользу поиска всего меню из одного каталога, а не сбора его от пяти поставщиков с пятью мастер-миксами.

Этап извлечения, который никто не афиширует

Каждая панель хороша настолько, насколько хороша нуклеиновая кислота, которая в нее входит. Фекалии, мазки и кровь с ЭДТА требуют разных химических препаратов для лизиса; Автоматическая экстракция магнитными шариками обеспечивает стабильный выход и удаляет ингибиторы, которые в противном случае сглаживают мультиплексную кривую. Лабораторное масштабирование от нескольких образцов в день до десятков переходит от экстрактора с 4 образцами к 16, 32 или 96, и это решение принимается одновременно с меню панели.

Написано командой разработчиков Medicare Vet на основе данных производителя, рекомендаций WOAH и опубликованных подтверждений. Не заменяет ветеринарную или лабораторную консультацию на вашем рынке.