Paneles de PCR multiplex en tiempo real versus pruebas de objetivo único: pruebas sindrómicas en el laboratorio veterinario

Por qué síndromes, no patógenos

El complejo de enfermedades respiratorias infecciosas caninas incluye el virus del moquillo, la parainfluenza, el adenovirus tipo 2, la influenza, el coronavirus respiratorio, Bordetella bronchiseptica y Mycoplasma cynos, en cualquier combinación. La enfermedad de las vías respiratorias superiores felinas combina calicivirus y herpesvirus con Mycoplasma, Chlamydia y Bordetella. La diarrea felina y canina abarca parvovirus, coronavirus, Giardia, Tritrichomonas, Cryptosporidium, Clostridium y Salmonella. Las encuestas de casos clínicos encuentran rutinariamente dos o más agentes en un tercio o más de las muestras positivas.

Una prueba de objetivo único en este entorno responde a la pregunta que hizo el médico, no a la pregunta que plantea el paciente. Un resultado negativo de parvovirus en un cachorro que vomita es tranquilizador sólo si también se conocen los resultados de coronavirus, Giardia y Clostridium. Un panel convierte una secuencia de conjeturas en una respuesta ordenada.

Cómo funciona la multiplexación

Cada objetivo tiene su propio par de cebadores y una sonda marcada con un fluoróforo diferente: FAM, HEX o VIC, ROX o Texas Red, Cy5 y, en instrumentos de seis canales, Cy5.5 o un tinte similar. El instrumento lee cada canal por separado en cada ciclo, por lo que un pozo informa una curva por objetivo. Un control interno, generalmente un gen huésped endógeno o una secuencia sintética enriquecida, ocupa un canal y confirma que la extracción funcionó y que la reacción no fue inhibida.

De cuatro a seis objetivos por pozo es el límite práctico para la mayoría de los instrumentos; Los paneles más grandes se construyen con dos o tres pocillos por muestra, razón por la cual un panel gastrointestinal de ocho elementos se empaqueta en varios tubos.

Cuánto cuesta la multiplexación y cómo se controla

Concurso de imprimaciones. Los objetivos comparten polimerasa, nucleótidos y tiempo de ciclo, por lo que un objetivo con carga alta puede suprimir la amplificación de uno con carga baja en el mismo tubo. Los paneles bien diseñados equilibran las concentraciones de cebadores y confirman durante la validación que el límite de detección de cada objetivo en el multiplex está dentro de aproximadamente un ciclo de su valor singleplex.

Charla cruzada. Los fluoróforos con espectros superpuestos sangran hacia canales vecinos; la calibración del instrumento y la elección del tinte del panel controlan esto, y la validación incluye muestras positivas únicas en cada canal para demostrarlo.

Interpretación. Un panel produce más positivos, algunos de ellos comensales o espectadores. Mycoplasma y Bordetella en particular se encuentran en portadores sanos, por lo que el informe debe incluir el valor de Ct, y el médico debe leer un Ct tardío en un organismo portador de manera diferente a un Ct temprano en el virus del moquillo.

Cuando un kit de un solo objetivo sigue siendo la elección correcta

Confirmación de un panel positivo con un ensayo independiente. Monitoreo cuantitativo de un patógeno a lo largo del tiempo, como la carga viral bajo tratamiento, donde la curva más limpia proviene de una reacción específica. Objetivos raros o exóticos que ningún panel porta, incluidos agentes zoonóticos como Brucella, Leptospira o Leishmania donde la cuestión clínica es específica. Pruebas regulatorias o de exportación que nombran un método. Y cualquier laboratorio cuyo instrumento tenga sólo uno o dos canales.

Construyendo un menú de panel

Un laboratorio veterinario que presta servicios de medicina general suele disponer de un panel respiratorio y un panel gastrointestinal para perros y gatos, un panel transmitido por vectores (Ehrlichia, Anaplasma, Babesia, Dirofilaria, Leishmania) configurado según el mapa local de garrapatas y flebótomos, y un conjunto de kits singleplex para confirmación y para cuestiones zoonóticas y reproductivas. Todos ellos funcionan con la misma extracción, el mismo instrumento y la misma plantilla de informes, lo cual es el argumento práctico para obtener todo el menú de un catálogo en lugar de ensamblarlo a partir de cinco proveedores con cinco mezclas maestras.

El paso de extracción que nadie anuncia.

Cada panel es tan bueno como el ácido nucleico que contiene. Las heces, los hisopos y la sangre con EDTA necesitan diferentes químicas de lisis; La extracción automatizada de perlas magnéticas proporciona un rendimiento constante y elimina los inhibidores que, de otro modo, aplanarían una curva múltiple. Un laboratorio que escala de un puñado de muestras al día a decenas pasa de un extractor de 4 muestras a 16, 32 o 96, y esa decisión se toma al mismo tiempo que el menú del panel.

Escrito por el equipo de producto Medicare Vet a partir de datos del fabricante, orientación WOAH y validación publicada. No sustituye el asesoramiento veterinario o de laboratorio en su mercado.